Caractéristiques de la culture des microalgues à l'aide d'air disponible dans le commerce

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 3792 (2023) Citer cet article

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Les emballages à coussin d'air (AC) sont devenus largement utilisés dans le monde entier. Les climatiseurs sont des solutions d'emballage en plastique double remplies d'air que l'on trouve couramment autour et protégeant les objets de valeur dans les enceintes d'expédition pendant le transport. Ici, nous rapportons une évaluation en laboratoire utilisant des AC comme photobioréacteur microalgal (PBR). Un tel PBR résout intrinsèquement bon nombre des problèmes opérationnels généralement rencontrés avec les étangs à circuit ouvert et les photobioréacteurs fermés, tels que la perte d'eau par évaporation, la contamination externe et la prédation. À l'aide d'AC à moitié remplis, les performances des espèces de microalgues Chlorella vulgaris, Nannochloropsis oculata et Cyclotella cryptica (diatomée) ont été examinées et le poids des cellules sèches sans cendres et la productivité globale de la biomasse ont été déterminés à 2,39 g/L et 298,55 mg/L/jour pour N. oculata, 0,85 g/L et 141,36 mg/L/jour pour C. vulgaris et 0. 67 g/L et 96,08 mg/L/jour pour C. cryptica. De plus, une productivité lipidique maximale de 25,54 mg/L/jour AFDCW et une productivité glucidique de 53,69 mg/L/jour AFDCW ont été atteintes par C. cryptica, tandis que la productivité maximale de protéines de 247,42 mg/L/jour AFDCW a été atteinte par N. oculata. Les données de ce travail seront utiles pour déterminer l'applicabilité et le profil du cycle de vie des AC réutilisés et réutilisés en tant que photobioréacteurs microalgaux potentiels en fonction du produit final d'intérêt, de l'échelle utilisée et des coûts de production.

Les activités humaines, telles que la surconsommation et la surpopulation, ont contribué à la détérioration environnementale de l'environnement biophysique par l'épuisement des ressources, la destruction des écosystèmes et des habitats et la pollution. Cela inclut, mais sans s'y limiter, l'épuisement des stocks de poissons sauvages et l'augmentation des niveaux de pollution plastique des océans. L'atténuation de ces effets délétères nécessitera un développement durable basé sur une méthodologie du lien eau-alimentation-énergie qui reconnaît l'interconnectivité des ressources environnementales, de la capacité et des déchets. Conformément à cela, les concepts de durabilité des 4R de réduire, réutiliser, recycler et réutiliser (repenser) sont intégrés plus fréquemment dans les approches d'évaluation environnementale du cycle de vie (ACV), en particulier celles qui formulent des stratégies de gestion des déchets plastiques et des politiques publiques1. Bien que ces 4R de la durabilité ne soient pas des concepts nouveaux, ils n'ont jamais été aussi importants qu'aujourd'hui dans un monde dont la population estimée à 9,8 milliards en 2050 reflète une augmentation de près de 2 milliards de personnes au cours des 30 dernières années. En supposant que les tendances démographiques se concrétisent, la production de microalgues sera de plus en plus nécessaire pour assurer un approvisionnement suffisant en protéines nutritives et autres bioproduits à la population mondiale2,3.

Au fil des ans, de nombreuses analyses technoéconomiques sur les microalgues ont été publiées, portant sur les bilans de gaz à effet de serre (GES)4 et les bilans d'utilisation de l'eau5,6. Bien qu'un intérêt et des efforts importants pour la culture à grande échelle des algues aient été explorés depuis des décennies, l'industrie est toujours en proie à des coûts de production élevés nécessitant le développement d'idées innovantes dans les méthodologies de culture et de récolte7. Les microalgues sont des organismes unicellulaires que l'on trouve couramment dans la nature et qui prospèrent dans de nombreuses conditions environnementales différentes. Certains de ces environnements peuvent être assez hostiles, ce qui entraîne le développement interne de mécanismes de survie pour contrer les facteurs de stress environnementaux. Bon nombre de ces réponses au stress cellulaire entraînent la biosynthèse de produits d'intérêt commercial, tels que les antioxydants et les caroténoïdes sous une exposition intense à la lumière ultraviolette, ainsi que des métabolites généraux et d'autres nutriments fonctionnels8. La production commerciale de microalgues est actuellement réalisée à l'aide d'une variété de modèles de culture, y compris des étangs de canalisation (RWP), des tubes, des sacs en plastique polyéthylène, des photobioréacteurs intérieurs et extérieurs (PBR) et des fermenteurs9,10,11,12. Souvent, les cultures extérieures de microalgues axéniques commencent par un inoculum cultivé à l'intérieur, où les prédateurs sont exclus et où les nutriments et les conditions environnementales sont contrôlés, puis sont transférés dans des réservoirs extérieurs ou des raceways pour une production de masse3.

Les résultats des évaluations détaillées « du berceau à la tombe » révéleront les stratégies appropriées de développement de la R&D et d'amélioration des projets pour les alternatives innovantes qui se présentent. Une de ces alternatives de bioraffinerie de microalgues est Bubble Farming (BF), où des feuilles de film plastique à bulles sont envisagées pour être fabriquées sur place à l'aide d'équipements agricoles modifiés, puis placées sur la surface du sol avec chaque bulle remplie d'un mélange aqueux d'algues spécifique pour une récolte ultérieure13. Les diamètres des feuilles et des bulles individuelles sont dimensionnés pour s'adapter à la saison de croissance et au terrain d'une région spécifique, à l'application prévue et à l'utilisation finale souhaitée, comme le Diafuel (biocarburant à base de diatomées)14. Le BF résout intrinsèquement de nombreux problèmes opérationnels généralement rencontrés avec les systèmes RWP ouverts et PBR fermés, tels que la perte d'eau par évaporation, la contamination externe et la prédation. Une autre alternative de bioraffinerie de microalgues est le bioréacteur en plastique OMEGA développé par la NASA15 pour l'assainissement des eaux usées de microalgues déployé à proximité des cages d'aquaculture offshore, près des communautés côtières à proximité des fermes aquacoles terrestres de taille familiale/agro-industrielle (permettant l'utilisation de terres non arables ou en jachère et la rotation BF/culture) ou l'évacuation des eaux usées en mer. OMEGA est un système de culture de microalgues utilisant des eaux usées contenues dans de grands PBR flottants en polyéthylène basse densité linéaire déployés dans des environnements marins, qui utilise l'osmose directe à travers les parois de la membrane tubulaire pour concentrer passivement les nutriments et assécher la biomasse microalgale pour une conversion ultérieure en biocarburants ou engrais16.

Dans la présente étude, les caractéristiques de culture des microalgues ont été évaluées à l'aide d'un matériau d'emballage en plastique à coussin d'air (AC) réutilisé et réutilisé comme photobioréacteur. Les AC sont des solutions d'emballage personnalisées à deux matériaux généralement fabriquées à partir de polyéthylène et expédiées remplies d'air. Les AC sont généralement trouvés entourant et protégeant des objets de valeur dans de nombreuses enceintes d'expédition pendant le transport. Le CA typique est constitué d'un mince film plastique recyclable, mais pas nécessairement biodégradable. Le passage des consommateurs des enveloppes à bulles aux coussins d'air pour l'emballage a été observé ces dernières années, principalement en raison de leur durabilité perçue et de leur facilité d'utilisation. Les climatiseurs occupent également moins d'espace dans les entrepôts, car ils sont généralement remplis d'air lors de leur utilisation, ce qui réduit les coûts de stockage, améliore l'utilisation de l'espace et permet une réutilisation lors des expéditions ultérieures. En fait, la taille du marché mondial des emballages AC devrait atteindre 4,4 milliards de dollars d'ici 2025, enregistrant un taux de croissance annuel composé de 7,0 %17. Cette croissance mondiale de la demande est attribuée à un besoin croissant de protection des marchandises contre les conditions de transit et les surfaces difficiles.

Compte tenu de l'expansion de la production de courant alternatif, il est important de recycler ou de réutiliser les matériaux utilisés ou excédentaires afin de réduire et d'atténuer les déchets plastiques qui en résultent. Une utilisation possible des AC est la culture de microalgues. Les AC réutilisés et réutilisés peuvent aider à réduire les investissements en capital dans l'entreprise de bioraffinerie de microalgues, tout en fournissant un environnement isolé et sans contaminant pendant la culture. De plus, les AC scellés résolvent intrinsèquement de nombreux problèmes opérationnels généralement rencontrés avec la bioproduction de microalgues RWP ouverte et fermée traditionnelle, telles que la perte d'eau par évaporation, la contamination externe et la prédation. Conformément à cela, à notre connaissance, une première évaluation en laboratoire de la culture de microalgues et de la production de biomasse et de lipides par trois espèces de microalgues (eau douce et marine), à ​​savoir Chlorella vulgaris UTEX 395, Nannochloropsis oculata CCMP 525 et diatomée Cyclotella cryptica CCMP 33218, a été menée pour déterminer si les AC disponibles dans le commerce et fréquemment jetés peuvent servir de PBR sans modification et à quel niveau de productivité.

La méthodologie utilisée dans cette étude s'est initialement concentrée sur une approche qualitative pour déterminer si un échange positif de gaz CO2 et O2 se produit à travers le matériau plastique non spécialement formulé du climatiseur. Suivie d'une approche quantitative dans laquelle les changements physiologiques des algues cultivées dans des AC-PBR dans les mêmes conditions abiotiques [lumière, CO2 (aération/échange de gaz), pH, température, volume] ont été déterminés en analysant la croissance, la composition biochimique et les profils d'acides gras. De plus, des tests de C. cryptica ont été effectués pour élucider les effets de la silice biogénique, qui comprenait une analyse du poids sec sans cendres et de l'azote élémentaire. Enfin, une analyse LC-MS (chromatographie liquide-spectroscopie de masse) a été réalisée pour déterminer la synthèse du caroténoïde fucoxanthine de haute valeur par la diatomée C. cryptica. Les données de cette évaluation seront utiles pour déterminer l'applicabilité conceptuelle et l'utilité des AC en tant que PBR microalgal autonome potentiel, ainsi que dans les analyses technico-économiques de l'ACV, les décisions économiques et de faisabilité finales dépendant de la valeur du produit final cible (biomasse, lipides, protéines ou glucides) développé et de l'échelle utilisée.

Nannochloropsis oculata CCMP 525 (ci-après N. oculata) et Cyclotella cryptica CCMP 332 (ci-après C. cryptica) ont été achetés auprès du National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) (Laboratoire Bigelow for Ocean Sciences, Maine, USA). N. oculata a été maintenu dans un milieu marin F/2 modifié en macronutriments (Phyto Technology Laboratories, États-Unis). C. cryptica a été maintenu dans un milieu marin L1 modifié en macronutriments (NCMA). Chlorella vulgaris UTEX 395 (ci-après C. vulgaris) a été achetée à la collection de cultures d'algues de l'Université du Texas (Austin, USA) et maintenue dans du Bold's Basal Medium (BBM, Phyto Technology Laboratories, USA). Le pH de tous les milieux a été fixé à 7,5 à l'aide d'un pH-mètre (Orion 3 Star, Thermo Fisher, USA). Pour la préparation de l'inoculum, les souches d'algues ont été cultivées dans les milieux respectifs à l'aide de flacons Erlenmeyer de 125 ml avec un volume de travail de 50 ml sous une lumière blanche continue d'une intensité de 100 µmol/m2s dans un agitateur incubateur (Excella E24, New Brunswick Scientific, Eppendorf, Allemagne) à 150 tr/min à 23 °C pendant 3 à 4 jours (phase log).

L'AC-PBR sélectionné pour les trois espèces de microalgues examinées ici était un matériau d'emballage AC disponible dans le commerce, généralement trouvé dans les boîtes d'expédition. Pour assurer la cohérence au cours de l'étude, un nombre suffisant d'unités de climatisation remplies d'air a été acquise (AIRplus par STOROpack), chacune mesurant 90 mm × 180 mm × 0,0254 mm (3,543 × 7,087 × 0,001 pouce) et fabriquées en polyéthylène basse densité transparent (LDPE). Certains de ces CA ont été conservés sur place pour les recherches discutées ici et certains ont été fournis à des collègues de l'Université Dr Hari Singh Gour en Inde pour leurs recherches19. Chaque AC-PBR d'origine peut théoriquement contenir ~ 380 ml de liquide. Bien que des expériences préliminaires menées à 1/4, 1/2 et 3/4 de capacité aient révélé des résultats de densité optique approximativement équivalents (OD680 nm) pour toutes les espèces d'algues testées, les résultats les plus cohérents ont été obtenus à la moitié de la capacité (données supplémentaires). Par conséquent, la configuration AC-PBR 1/2 remplie (~ 190 ml) a été sélectionnée dans cette étude.

La première étape pour déterminer si la croissance se produira en fait et à quel niveau de productivité a consisté à déterminer si un échange de gaz CO2 et O2 se produirait à travers la surface AC-PBR. Les résultats qualitatifs de l'échange de gaz CO2 et O2 à travers la surface de l'AC-PBR sont rapportés dans la section "Détermination de l'échange de gaz dans l'AC-PBR".

CO2 : Deux AC-PBR ont été remplis de gaz CO2 pur comprimé fourni par Airgas (États-Unis), thermoscellés et immergés sous l'eau pour confirmer l'absence de fuite. Un AC-PBR (initialement rempli à 250 ml) a été placé sur la table de laboratoire à 23 ° C pour observer si le CO2 diffusait à travers le plastique LDPE dans l'atmosphère pendant la nuit sous un gradient positif. Le deuxième AC-PBR (initialement rempli à 300 ml de CO2) a été immergé dans un récipient couvert d'eau à un pH initial de 7,1. Le volume total à l'intérieur du récipient était de 5,5 L sans aucune bulle observée s'échappant de l'AC-PBR ni attachée à la surface.

O2 : Deux PBR AC ont été remplis de gaz O2 pur comprimé fourni par Bernzomatic (États-Unis), thermoscellés et immergés sous l'eau pour confirmer l'absence de fuite. Un AC-PBR a été placé sur la table du laboratoire pour observer visuellement si l'O2 diffusait à travers le plastique LDPE dans l'atmosphère sous un gradient positif pendant la nuit. Le deuxième AC-PBR a été immergé dans un récipient d'eau couvert d'un volume total de 3,0 L sans bulles observées s'échappant de l'AC-PBR ni attachées à la surface.

La plupart des enquêtes sur les microalgues décrivent des PBR avec une certaine forme de distribution active et continue de gaz CO2 comprimé filtré comme source de carbone. Bien que les résultats d'échange de gaz AC CO2 aient été prometteurs, une inquiétude subsistait quant à savoir si suffisamment de CO2 serait présent tout au long de la période de culture simplement par échange de gaz à travers la surface AC-PBR. Un test préliminaire de C. vulgaris a révélé que si les microalgues restaient visuellement vertes, la croissance mesurée par OD680 nm n'a augmenté que de 10,8 % sur la période de test de 10 jours sans supplémentation supplémentaire en CO2. Pour améliorer la croissance des souches d'algues, nous avons ajouté du bicarbonate de sodium (NaHCO3 = 48 g/L) aux AC-PBR de C. vulgaris et de N. oculata. Cette procédure a été encore modifiée en faisant barboter initialement dans du gaz CO2 comprimé filtré jusqu'à ce que la saturation de la solution soit atteinte (c'est-à-dire en abaissant le pH stabilisé) suivi par le titrage du milieu avec une solution saturée de bicarbonate de sodium à un pH de 7.

Une intensité lumineuse appropriée est un paramètre important pour garantir que la source d'énergie nécessaire à la photosynthèse passe non seulement à travers la surface en plastique AC-PBR, mais pénètre également suffisamment loin à l'intérieur pour réduire les effets d'ombrage de cellule à cellule20. Un luxmètre portable (modèle CA813, AEMC Instruments) a été utilisé pour mesurer l'intensité lumineuse en lumens par mètre (lux) à la surface du PBR AC. Des tests ont été effectués sur C. vulgaris et N. oculata dans trois conditions : (1) Une lumière (Airand CT-X01A600-18 lampes LED blanches naturelles) à 77 µmol/m2s, sans agitation avec une photopériode de 16:8 h (lumière : obscurité) ; (2) Une lumière sur une table vibrante à 75 tr/min et 65 µmol/m2s avec un éclairage 24 h (continu) ; et (3) Deux lumières à un total de 180 µmol/m2s avec une photopériode de 16:8-h (lumière:obscurité). Les résultats initiaux utilisant un milieu amélioré sans CO2 n'ont révélé aucune différence significative de DO entre la table à agitateur et la configuration à une lumière sans agitateur, mais les résultats à deux lumières sans agitateur étaient légèrement meilleurs que la configuration à une lumière (données non présentées). Par conséquent, deux rangées de lumières LED ont été sélectionnées comme configuration de test d'éclairage intérieur de référence.

À l'appui de l'objectif de déterminer si la croissance cellulaire se produira en fait dans l'AC-PBR et à quel niveau de productivité, deux essais avec chacune des trois espèces de microalgues sélectionnées ont été effectués dans les milieux respectifs. Un inoculum initial (DO680 nm = 0,6–0,8) de 10 % (v/v) a été utilisé pour toutes les espèces examinées. Une fois que la DO cellulaire appropriée a été obtenue dans les flacons de culture de secoueur, chaque suspension d'algues a été récoltée et ajoutée au milieu fraîchement préparé, comme décrit dans la section "Culture des microalgues". Avant l'ajout des algues, le milieu a été amélioré par barbotage dans du gaz CO2 comprimé filtré jusqu'à ce que la saturation de la solution soit atteinte (c'est-à-dire, baisse du pH stabilisée) suivi par l'ajout de bicarbonate de sodium saturé (NaHCO3 = 48 g/L) jusqu'à ce qu'un pH neutre soit atteint. Le volume final a été augmenté de manière stoechiométrique avec une solution de macronutriments en fonction de la quantité de NaHCO3 ajoutée.

Avant le début du test AC-PBR, chaque AC-PBR rempli d'air a été placé sous une lampe germicide UV-C pendant 15 minutes pour stériliser le volume intérieur et prévenir la contamination. À travers une petite ouverture dans l'AC, environ 190 ml (volume de travail) de suspension de cellules d'algues ont été pipetés à l'intérieur avec tout air supplémentaire éliminé, et l'AC-PBR (volume total 380 ml) a été refermé à l'aide d'une machine à sceller sous vide externe VacMaster Pro110. Le système a été vérifié pour les fuites.

Les AC-PBR pour chaque souche d'algue ont été conservés sous deux rangées de LED avec une intensité lumineuse de 180 µmol/m2s avec une photopériode de 16: 8 h (clair: sombre), sans agitation à 25 ° C. La culture a été effectuée jusqu'à ce que chaque algue atteigne une phase stationnaire précoce (C. vulgaris - 6 jours, N. oculata - 8 jours et C. cryptica - 7 jours). Des photos de la configuration du test de culture de microalgues AC-PBR pour chaque souche sont disponibles dans les données supplémentaires.

La croissance des algues en termes de densité optique à 680 nm (DO680 nm) à l'aide d'un spectrophotomètre (DU 730, Beckman Coulter, Brea, CA, USA) et de poids de cellule sèche (DCW, g/L) a été évaluée en double pour chaque espèce d'algue21,22. Toutes les 24 h, la DO a été mesurée pour chacune des algues afin d'en déduire une courbe de croissance. Le nitrate (NO3−), le nitrite (NO2−), le phosphate (PO4−) et le pH ont été mesurés toutes les 24 h à l'aide de bandelettes réactives (Hach Company, Loveland, Colorado, États-Unis et Micro Essential Laboratory (HYDRION), Brooklyn, New York, États-Unis). À la fin de la culture, les cellules d'algues ont été récoltées par centrifugation à 5000 g pendant 10 min à 25 ° C et lavées deux fois avec de l'eau distillée (C. vulgaris) ou une solution de NaCl à 0,9% (N. oculata et C. cryptica) pour éliminer les composants du support. La biomasse résultante a ensuite été placée dans un four à 50 ° C pour sécher pendant une nuit. La DCW a été déterminée par gravimétrie à l'aide d'une balance numérique de table (Mettler Toledo, USA) conformément à l'équation suivante :

Les valeurs DCW sont généralement utilisées directement dans les espèces de microalgues contenant des niveaux de cendres < 10 %. Cependant, les diatomées contiennent généralement une quantité considérable de cendres minérales en raison de la contribution de l'exosquelette de silice non carboné23, bien que même les algues vertes puissent présenter une teneur en cendres de 10 % ou plus24. En conséquence, chez les espèces présentant des pourcentages de cendres plus élevés, le poids sec sans cendres (AFDCW ; g/L) a été déterminé pour assurer une mesure précise de la concentration et de la productivité des constituants biochimiques individuels, car l'analyse de la composition basée uniquement sur les mesures DCW peut sous-estimer la quantité réelle25. Pour la mesure AFDCW, de la biomasse sèche a été ajoutée à des plateaux de pesée en aluminium pré-pesés, puis repesée. Les casseroles ont ensuite été placées dans un four à moufle et oxydées (incinérées) à 475 ° C pendant 5 h. Après refroidissement, les échantillons ont été repesés et enregistrés. L'AFDCW % a été calculé conformément à l'équation suivante :

En raison des préoccupations susmentionnées concernant la teneur élevée en cendres, l'AFDCW a été utilisée tout au long de cette étude et déterminée conformément à l'équation suivante :

Pour chaque configuration expérimentale, la teneur totale en lipides, la teneur totale en glucides et la teneur totale en protéines ont été mesurées à l'aide de protocoles publiés précédemment26. En bref, la rupture cellulaire a été effectuée mécaniquement avec de l'azote liquide suivi de l'ajout de chloroforme / méthanol (2: 1 v / v) en utilisant la méthode modifiée de Bligh et Dyer pour le fractionnement et la séparation des lipides. Les lipides totaux ont été extraits de la phase chloroformique, séchés sous vide et mesurés par gravimétrie. Les glucides totaux ont été mesurés à l'aide de la méthode de l'acide sulfurique au phénol avec une biomasse hydrolysée à l'acide, et les protéines totales ont été calculées comme le reste de 100 % après que le % de lipides, le % de glucides et le % de cendres ont été soustraits27,28. La productivité de la biomasse, la teneur en lipides et la productivité des lipides ont été calculées à l'aide des formules ci-dessous :

La préparation des échantillons a été effectuée à l'aide de protocoles standard29 et la détermination des FAME a suivi les protocoles précédemment publiés30. Plus précisément, les lipides totaux extraits (5 à 10 mg) des cellules d'algues ont été dissous dans du chloroforme, transférés dans un flacon en verre transparent, puis du HCl méthanolique 0, 6 M avec C13 a été ajouté comme étalon interne aux flacons en verre, qui ont été scellés et chauffés à 85 ° C pendant 1 h pour que la réaction de transestérification se produise. Les flacons ont ensuite été refroidis à température ambiante, scellés et stockés dans un congélateur à -20 ° C jusqu'à ce que l'extraction FAME se produise à l'aide d'hexane par analyse GC – MS (Agilent Technologies 7200 GC – MS). La composition de FAME a été identifiée à l'aide de la base de données de référence standard spectrale de masse du NIST (National Institute of Standards and Technology). L'identification et la quantification des FAME ont été faites en analysant les temps de rétention et en utilisant des rapports de recherche en bibliothèque (base de données NISTIL.S).

Pour l'extraction de la fucoxanthine à partir de C. cryptica, 50 mg de biomasse lyophilisée ont été broyés à l'aide d'azote liquide suivi d'une extraction des caroténoïdes à l'aide d'éthanol (100%). La suspension cellulaire a été transférée dans un flacon en verre et incubée pendant une nuit à 4°C dans l'obscurité. Le processus a été répété jusqu'à ce que le culot cellulaire devienne incolore. Les extraits d'éthanol ont ensuite été séchés sous vide et remis en suspension dans 1 ml de méthanol pour LC-MS à l'aide d'Agilent technologies 6460 Triple Quadripôle (QQQ) (Agilent 1100 Series, K1260 Infinity (2) stack). La séparation et la détermination de la fucoxanthine ont été effectuées sur la base d'un protocole publié précédemment30. La phase mobile était constituée de méthanol et d'eau avec un débit de 0,400 mL/min à 35 °C avec une élution en gradient dans une colonne en phase inverse C18 Eclipse Plus (Agilent, Santa Clara, CA USA) et un chromatogramme enregistré à 445 nm. L'étalon de fucoxanthine (numéro de catalogue F6932-10 mg, numéro de lot MKCP1541, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) a été utilisé à la fois pour confirmer la présence et l'emplacement des fragments d'ions précurseurs élués et pour construire la courbe d'étalonnage sur une plage de concentration de 1 à 10 µg/mL (données supplémentaires).

Les résultats LC-MS ont également été comparés aux mesures spectrométriques. Pour l'analyse spectrophotométrique, les caroténoïdes ont été dissous dans 1 ml d'hexane et l'absorbance a été lue à 663 nm et 445 nm. La concentration de fucoxanthine a été calculée à l'aide d'une courbe d'étalonnage de fucoxanthine (0,2–10 µg/mL) (données supplémentaires). L'absorbance de la fucoxanthine à 445 nm a été corrigée en soustrayant l'absorbance à 663 (interférence de la chlorophylle). Cette correction est nécessaire car la courbe d'étalonnage ne concerne que la fucoxanthine et il existe un chevauchement possible entre les absorptions de chlorophylle (A et C à 663) et de fucoxanthine (à 445).

Toutes les expériences ont été réalisées en double avec la valeur moyenne ± écart type (SD) étant rapportée. Les données ont été tracées à l'aide de Graph Pad Prism v 9.4.

Pour déterminer l'échange de gaz dans les AC-PBR, les taux de diffusion de CO2 et d'O2 à travers le plastique LDPE ont été estimés qualitativement. L'AC-PBR rempli de CO2 (300 mL) était plat après ~ 24 h confirmant la diffusion du gradient du CO2 enfermé vers l'air extérieur. De plus, l'AC-PBR immergé dans l'eau avec un pH initial de 7,1 était également plat après ~ 24 h et le pH de l'eau abaissé à 5,7, confirmant ainsi à nouveau la diffusion en gradient du CO2 enfermé dans l'eau et la formation ultérieure d'acide carbonique (H2CO3). Afin de déterminer s'il y avait une quelconque directionnalité sur le transfert dans l'air, un AC-PBR rempli d'air séparé, tel que reçu, a été placé dans un bocal en verre scellable à large ouverture avec le bocal rempli de CO2 et fermé. Le lendemain matin, de même, après ~ 24 h, la hauteur de l'AC-PBR s'est avérée avoir gonflé d'environ 4 fois à un diamètre plus grand que l'embouchure du pot, confirmant la diffusion sous un gradient de CO2 extérieur à travers la paroi AC LDPE dans la région intérieure remplie d'air.

De même, les AC-PBR remplis d'O2 pur se sont avérés plus petits en volume après ~ 24 h qu'à l'origine, mais pas aussi plats que dans le test de CO2 précédent, confirmant la diffusion de l'O2 enfermé dans l'air extérieur sous un gradient, mais à un taux beaucoup plus faible que le CO2. L'AC-PBR submergé semblait également avoir un volume légèrement inférieur avec le volume d'eau total réduit à ~ 2,95 L, confirmant également l'apparition de la diffusion de l'O2 enfermé vers l'eau extérieure sous un gradient mais à un taux beaucoup plus faible que le CO2. Une chose à noter était la présence de nombreuses petites bulles attachées à la surface de l'AC-PBR qui étaient présentes dans le test O2 immergé dans l'eau mais n'étaient pas présentes dans le test CO2 immergé dans l'eau.

En conclusion, il a été observé que le CO2 et l'O2 diffusaient à travers la surface AC-PBR sous un gradient positif, le CO2 diffusant à un taux beaucoup plus élevé. Cette observation est étayée par la littérature, comme le rapporte Guisheng31, qui a cité des valeurs relatives de perméabilité pour le CO2 et l'O2 de 10,7 et 3,1, respectivement, pour le LDPE à 30°C32. Les découvertes ci-dessus ont complété les résultats de Khan19 qui a rempli des bocaux en verre à large ouverture avec de l'eau de bassin et les a scellés avec une seule feuille de film plastique AIRplus AC tendue sur le bord du bocal et fixée avec deux élastiques. Les résultats après 50 jours ont révélé que les algues restaient vertes sans perte de volume d'eau observée, confirmant que les algues présentes avaient subi un échange suffisant de gaz (CO2 et O2) nécessaires à la photosynthèse et à la respiration. Dans l'ensemble, ces résultats positifs combinés justifiaient la poursuite de l'étude de culture d'algues dans les AC au cours de laquelle tout effet délétère sur la durée de croissance et/ou les performances par l'accumulation de toxicité de l'O2 et la perte d'eau serait surveillé.

Même si nous avons observé un transfert de gaz efficace via la surface AC-PBR, pour garantir que le CO2 est présent tout au long de la période de culture, les milieux respectifs pour chaque souche d'algue ont été complétés avec 48 g/L de NaHCO3 en plus du barbotage de CO2. Cela a établi notre système de tampon CO2-bicarbonate33 qui a considérablement augmenté la DO680 nm de près de quatre fois pour C. vulgaris et de près de huit fois pour N. oculate par rapport aux milieux frais et marins non enrichis en CO2 (données non présentées). Sur la base de ces observations, la procédure de barbotage dans le CO2 suivie de l'ajout de bicarbonate de sodium à un pH neutre a été intégrée à la configuration de base pour toutes les espèces testées, y compris la diatomée C. cryptica.

Pour examiner l'applicabilité des AC-PBR en plastique réutilisés et réutilisés pour la culture de microalgues, nous avons sélectionné trois souches d'algues fraîches et marines : C. vulgaris, N. oculata et C. cryptica. C. vulgaris est une microalgue verte modèle d'eau douce souvent utilisée comme complément alimentaire ou additif alimentaire riche en protéines et est également signalée comme accumulant une biomasse élevée et une teneur élevée en lipides intracellulaires33. N. oculata est une algue verte marine photoautotrophe, unicellulaire et flottante souvent utilisée en aquaculture comme source de nourriture riche en énergie pour les larves de poissons et les rotifères34,35. De plus, elle est considérée comme une algue prometteuse pour les applications industrielles et nutraceutiques en raison de sa capacité, dans des conditions de culture appropriées, à accumuler des niveaux élevés d'acides gras polyinsaturés (AGPI) et de caroténoïdes, tels que l'astaxanthine, la zéaxanthine et la canthaxanthine. C. cryptica est une diatomée marine unicellulaire photo/hétérotrophe, flottant librement et centrée (algue brune) souvent utilisée dans les aliments pour l'aquaculture36. Elle est considérée comme une algue prometteuse pour les applications industrielles et nutraceutiques en raison de sa capacité à accumuler des niveaux élevés d'AGPI et du caroténoïde fucoxanthine37,38. De plus, comme les diatomées sont caractérisées par une coquille de silice hydratée amorphe presque pure (frustule), elles peuvent également servir de source potentielle de silice biogénique pour des applications de haute qualité39,40. Enfin, C. cryptica est également connu pour produire des nanofibrilles (fibres) de β-chitine3,41, qui peuvent être utilisées dans la fabrication de biomembranes et de bioplastiques qui ont une meilleure biodégradabilité que les plastiques42,43,44. La production de plastiques biosourcés à partir de ressources naturelles avec des niveaux élevés de protéines et de polymères à base de glucides présente une alternative biodégradable pour remplacer ou compléter les plastiques traditionnels à base de pétrole45,46.

Notamment, les trois souches d'algues ont pu s'adapter et se développer dans les AC-PBR avec N. oculata montrant le niveau de croissance le plus élevé car il a atteint une DO680 nm de 4, 01 ± 0, 20 suivi de C. vulgaris et C. cryptica (Fig. 1A). Les souches d'algues ont affiché une phase de latence d'un jour (0 à 1 jour) suivie d'une croissance entre les jours 2 et 5. Selon les courbes de croissance, C. vulgaris a atteint une phase stationnaire précoce (temps de récolte) le 6ème jour, tandis que N. oculata et C. cryptica ont continué à croître jusqu'aux 8ème et 7ème jours, respectivement (Fig. 1A). La mesure approximative des nitrates et phosphates résiduels a révélé l'épuisement de ces deux macronutriments dans les cultures de C. vulgaris au 6e jour, tandis que les cultures de N. oculata et C. cryptica avaient 250 mg/L et 10 mg/L de nitrate et de phosphate résiduels aux 8e et 7e jours, respectivement, expliquant la durée de croissance plus longue. Puisqu'il est connu que certaines algues marines et diatomées contiennent des minéraux et de la silice à 22-47% de la biomasse totale, nous avons ajusté le DCW pour toutes les souches d'algues afin d'éviter une surestimation de la biomasse. Une revue de la littérature a révélé de faibles niveaux de cendres pour C. vulgaris à environ ~ 5–6%47,48, donc conformément aux pratiques de recherche courantes, aucun ajustement relatif au % de cendres n'a été effectué ici (c'est-à-dire AFDCW (g) = DCW (g)). Une revue de la littérature pour N. oculata et Nannochloropsis sp. ont révélé des niveaux de cendres constants à 24,5 et 27,3 %49,50, respectivement ; par conséquent, pour cette analyse, une valeur moyenne de teneur en cendres de 25,9 % a été utilisée ici. L'examen de la littérature sur les diatomées a révélé que Hildebrand26 comparait huit espèces de diatomées différentes avec des teneurs en cendres de 49 à 59 %, les diatomées ayant en moyenne deux fois la teneur en cendres d'une variété d'algues non silicifiées et quatre fois la teneur de deux espèces de Chlamydomonas examinées. En raison de la plus grande valeur d'amplitude et de la variation de la teneur en silice notée pour le calcul de la teneur organique du poids sec des espèces de diatomées, des mesures directes en double de l'AFDCW% ont été effectuées pour C. cryptica en utilisant la valeur moyenne de la teneur en cendres de 45,4%.

(A) Courbe de croissance (OD680 nm); et (B) Poids des cellules sèches sans cendres (AFDCW; g/L) et productivité de la biomasse (mg/L j) de C. vulgaris, N. oculata et C. cryptica cultivés en AC-PBR.

Dans l'ensemble, la productivité la plus élevée de l'AFDCW et de la biomasse de 2,39 g/L et 298,55 mg/L/jour a été atteinte par N. oculata, suivi de C. vulgaris à 0,85 g/L et 141,36 mg/L/jour, et de C. cryptica à 0,67 g/L et 96,08 mg/L/jour (Fig. 1B). Les valeurs de référence publiées de la productivité de la biomasse algale pour les RWP et PBR traditionnels se situent généralement entre 0,5 et 1 g/L et 2 et 6 g/L, respectivement51. Par conséquent, la productivité de la biomasse AC-PBR observée des souches d'algues était comparable à celles rapportées pour les PBR et les RWP intérieurs (tableau 1)52,53,54, ce qui rend crédible le potentiel d'utilisation rentable des AC en tant que PBR qui serviraient de système de culture d'algues riche en nutriments.

Selon les espèces, la biomasse des microalgues est principalement composée de glucides (4 à 64 %), de lipides (4 à 45 %) et de protéines (6 à 71 %)55. Comme indiqué précédemment, l'inclusion de la teneur en cendres dans la composition biochimique peut conduire à une surestimation des macromolécules, ainsi les protéines totales, les glucides totaux et les lipides totaux ainsi que leurs productivités respectives ont été calculés sur une base AFDCW (Fig. 2A, B). La teneur maximale en lipides (26, 58 ± 0, 30% AFDCW) a été atteinte chez C. cryptica, suivi de C. vulgaris à 17, 66 ± 0, 30% AFDCW et N. oculata à 6, 82 ± 0, 21% AFDCW (Fig. 2A). De même, la productivité lipidique maximale (25,54 ± 0,33 mg/L/jour AFDCW) a été atteinte par C. cryptica, suivie de près par C. vulgaris à 24,96 ± 0,31 mg/L/jour, puis N. oculata à 20,35 ± 0,51 mg/L/jour (Fig. 2B). Il convient de noter que C. vulgaris, qui présentait une concentration de biomasse plus faible que N. oculata et une concentration de biomasse plus élevée que C. cryptica, avait une productivité lipidique non significativement différente de l'une ou l'autre (Fig. 2B). Comme mentionné dans la section précédente, le nitrate était complètement appauvri dans les cultures de C. vulgaris, tandis que le milieu F/2 modifié par N. oculata et le milieu C. cryptica L1 contenaient du nitrate résiduel (50 à 250 mg/L) à la fin du cycle de culture. En effet, des études antérieures ont rapporté que la privation d'azote déclenche la biosynthèse des lipides intracellulaires par plusieurs algues. Par conséquent, l'augmentation de la teneur en lipides des espèces d'algues pourrait être attribuée à l'appauvrissement en azote56,57.

(A) Composition biochimique (%); et (B) productivité (mg/L j) de C. vulgaris, N. oculata et C. cryptica cultivés en AC-PBR.

Il a été rapporté que les algues synthétisent initialement des glucides sous un stress nutritif précoce suivi d'un passage à la biosynthèse des lipides, lorsque le stress est prolongé58. En raison de la grande quantité de silice présente dans la biomasse de diatomées de C. cryptica, nous n'avons pas pu utiliser la méthode standard d'acide sulfurique au phénol et le test de Bradford pour mesurer la teneur totale en glucides et en protéines, respectivement, et avons donc opté pour l'analyse élémentaire (CHNS). La teneur en protéines de la diatomée a été estimée par le facteur de conversion de l'azote en protéine (NtP). La valeur de conversion NtP souvent utilisée est de 6,25 basée sur des céréales utilisant une composition élémentaire commune de C40H62N10O12 pour les protéines59, la teneur en azote de la formule étant de 16 % et son inverse (1/0,16) égalant 6,2560,61. Cependant, des recherches ultérieures ont indiqué que cette valeur était peut-être trop élevée et qu'un facteur moyen de 4,78 devrait être utilisé pour la biomasse algale, avec 4,68 mesuré pour la diatomée Phaeodactylum tricornutum62. Les données d'analyse CHNS ont montré un % N de 2,05 ± 0,07 dans la biomasse de C. cryptica correspondant à une teneur totale en protéines de 9,6 % de DCW. La teneur en glucides AFDCW a ensuite été calculée en soustrayant la teneur totale en lipides AFDCW et la teneur totale en protéines AFDCW. La productivité en glucides basée sur l'AFDCW la plus élevée a été observée chez C. cryptica à 53,69 ± 0,19 mg/L/jour, suivi de N. oculata à 30,78 ± 1,81 mg/L/jour et de C. vulgaris à 22,61 ± 2,72 mg/L/jour (Fig. 2B). La productivité protéique basée sur l'AFDCW la plus élevée a été observée chez N. oculata à 247,42 ± 14,16 mg/L/jour, suivi de C. vulgaris à 93,80 ± 1,74 mg/L/jour et de C. cryptica à 16,85 ± 0,03 mg/L/jour (Fig. 2B). Dans l'ensemble, les valeurs de productivité biochimique des protéines, des lipides et des glucides sont comparables à celles rapportées dans la littérature pour ces souches cultivées dans des PBR intérieurs, renforçant le potentiel de l'AC-PBR en tant que système de culture durable à faible coût qui contribue à la réutilisation du plastique (tableau 1).

La détermination du profil FAME de C. vulgaris, N. oculata et C. cryptica cultivés dans des AC-PBR a été effectuée pour étudier les changements dans le profil des acides gras. Le profil FAME de C. vulgaris s'est avéré comprendre principalement de l'acide palmitique (16:0), de l'acide hexadécatriénoïque (16:3), de l'acide oléique (18:1), de l'acide linoléique (C18:2) et de l'acide stéarique (C18:0), ce qui est conforme aux études précédemment publiées6,58 (Fig. 3). Les acides gras saturés (SFA, pas de doubles liaisons), les acides gras monoinsaturés (MUFA, une double liaison) et les acides gras polyinsaturés (PUFA, deux ou plusieurs doubles liaisons) représentaient respectivement 34,25 %, 43,62 % et 22,14 % de la teneur totale en acides gras. Comme indiqué précédemment, le nitrate a été appauvri dans les cultures de C. vulgaris, provoquant apparemment l'accumulation observée de C18: 1, qui joue un rôle vital dans l'extinction des espèces réactives de l'oxygène générées lors de la privation de nutriments26. De plus, une teneur plus élevée en MUFA et PUFA est favorisée en cas d'épuisement des nutriments car ils sont des précurseurs de la biosynthèse des lipides membranaires et aident à la modulation de la membrane. Le profil FAME de N. oculata comprenait principalement C16: 0, C16: 3, C18: 1 et C18: 2, avec de petites quantités d'acide eicosapentaénoïque (EPA) C20: 5 et C24: 1 (Fig. 3). Les AGS, les AGMI et les AGPI représentaient respectivement 34,96 %, 39,57 % et 25,47 % des acides gras totaux. Ces résultats sont conformes au profil FAME précédemment rapporté pour Nannochloropsis sp.30,34. Les lipides membranaires de N. oculata contiennent des AGPI à longue chaîne (LC), y compris EPA, C20:4 et C24:1, qui contribuent à la présence de ces acides gras dans la biomasse algale. Enfin, le profil FAME de C. cryptica comprenait principalement C14: 0, C16: 0, C16: 1, C16: 2, C16: 3, C20: 5 et l'acide docosahexaénoïque (DHA) C22: 6 (Fig. 3). Les AGS, les AGMI et les AGPI représentaient respectivement 40,63 %, 35,94 % et 23,43 % des acides gras totaux. Ces résultats sont cohérents avec le contenu lié aux diatomées trouvé dans la littérature, y compris la présence de DHA (0,74%), des niveaux relativement élevés d'EPA (7,58%) et des traces d'acides gras C1863,64.

Profil FAME relatif (%) de C. vulgaris, N. oculata et C. cryptica cultivés en AC-PBR.

Dans les applications d'utilisation finale, les MUFA produisent un meilleur biodiesel, compte tenu de la fluidité à basse température et de la stabilité oxydative, tandis que les PUFA, comme le DHA et l'EPA, se sont révélés bénéfiques pour la santé humaine avec des produits finaux utilisés dans les industries pharmaceutiques et cosmétiques, ainsi que dans les compléments alimentaires pour le caroténoïde fucoxanthine. Les trois souches présentaient une productivité lipidique comparable pour la production de biocarburants, de nutraceutiques et de bioplastiques via les protéines riches en C. vulgaris44,65 et N. oculata ou les nanofibrilles de β-chitine de C. cryptica. De plus, selon le processus d'extraction des coproduits utilisé, la biomasse algale restante, qui est riche en protéines, pourrait servir de matière première pour augmenter l'alimentation des animaux et de l'aquaculture, ainsi que contribuer aux besoins nutritionnels humains causés par l'augmentation de la population, les changements climatiques et la disponibilité décroissante des terres arables pour l'agriculture42,66.

La fucoxanthine est un caroténoïde marin majeur présent en abondance dans les macroalgues (algues) et les microalgues, contribuant à environ 10 % de la production totale estimée de caroténoïdes dans la nature67,68. Chez les microalgues, en particulier chez les diatomées comme C. cryptica, la fucoxanthine de couleur orange (C42H58O6) est l'un des principaux pigments cellulaires photosynthétiques et des caroténoïdes non provitamine A utilisés par la cellule pour récolter la lumière et transférer l'énergie69,70, les deux autres principaux pigments photosynthétiques récoltant la lumière étant la chlorophylle a (chl a) et la chlorophylle c (chl c)8. Ces dernières années, la fucoxanthine a été étudiée en tant que complément alimentaire pour ses activités thérapeutiques anti-inflammatoires, anti-tumorales, anti-obésité, anti-diabète et anti-malaria71. Actuellement, la fucoxanthine est principalement produite à partir d'algues à croissance lente et à faible teneur en fucoxanthine. Les microalgues à croissance plus rapide sont une option alternative importante pour la production de fucoxanthine en raison de leurs caractéristiques de culture et d'évolutivité plus faciles72. L'analyse LC-MS de C. cryptica cultivée en AC-PBR a montré une concentration en fucoxanthine de 0,868 mg/g DCW (0,474 mg/g AFDCW) et une productivité en fucoxanthine de 0,570 mg/L j (0,311 mg/L j AFDCW) (Fig. 4). Les résultats LC-MS étaient comparables aux résultats spectrophotométriques de concentration de fucoxanthine (0,822 mg/g DCW), qui s'est avéré être une méthode beaucoup plus simple et plus rapide pour détecter la fucoxanthine dans des échantillons de diatomées. La valeur de productivité de fucoxanthine DCW calculée de 0,570 mg/L j était plus du double de la valeur supérieure de la plage de ~ 0,23 mg/L j pour 13 diatomées, y compris C. cryptica (CCMP 333 ; ~ 0,12 mg/L j) cultivées dans des flacons Erlenmeyer dans un milieu SK modifié à une intensité lumineuse inférieure de 30 µmol/m2s et une période de culture plus longue de 14 jours37.

Concentration de fucoxanthine (mg/g DCW) et productivité (mg/L j) chez C. cryptica cultivé en AC-PBR.

La culture de microalgues vers un seul bioproduit a rencontré un succès économique limité à ce jour. Cette prise de conscience entraîne un changement d'orientation de l'ensemble de l'entreprise vers une structure de bioraffinerie multi-produits dans laquelle les produits ciblés, les co-produits et les améliorations du système dans la conception contribuent positivement au succès global de l'opération en améliorant l'économie du processus. Dans cette étude, nous avons effectué une évaluation en laboratoire des AC en tant que PBR à faible coût et à faible main-d'œuvre pour cultiver C. vulgaris, N. oculata et la diatomée C. cryptica. AC réutilisés et réutilisés (1) Réduire et atténuer la fabrication et les déchets de plastique contribuant aux efforts de développement durable ; (2) réduire les investissements en capital dans les bioraffineries ; et (3) Fournir un environnement isolé et exempt de contaminants pendant la croissance des algues et la synthèse des bioproduits. Les données générées se comparaient favorablement aux valeurs PBR traditionnelles trouvées dans la littérature pour la productivité de la biomasse algale, des lipides et de la fucoxanthine, formant ainsi un point de référence pour d'autres PBR à base de sacs en plastique à base de polyéthylène de différentes conceptions et configurations à l'étude. En fin de compte, l'applicabilité et l'utilité des CA dépendront du degré d'optimisation des produits développés, de l'échelle utilisée et de l'économie globale. Plusieurs applications d'utilisation directe sont envisagées pour les AC-PBR, notamment la fabrication de produits/molécules de grande valeur et l'étude de voies de culture alternatives, telles que la culture de biofilms de microalgues.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles sur le référentiel de données en ligne Box.com, https://usf.app.box.com/s/3nctk2w36hwn7cjwqk7v4a4lpnxduuv6.

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Ce travail a été soutenu en partie par le Collège des sciences marines (CMS) de l'USF, le Laboratoire des biocarburants et des bioproduits du Dr Philippidis au Patel College of Global Sustainability de l'USF ; l'installation USF Chemical Purification, Analysis, and Screening Core grâce à l'accès aux équipements LC-MS/MS Q-TOF, GC-MS/MS et de lyophilisation ; Laboratoire de chimie environnementale CMS de l'USF pour les mesures des isotopes et de la composition globale de l'azote et du carbone par CF-EA-IRMS ; le Centre national Bigelow pour les algues marines et le microbiote pour les tests de poids sec sans cendres ; et Dialytics, Inc. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Richard Gordon pour son introduction à Bubble Farming.

Collège des sciences marines, Université de Floride du Sud, Saint-Pétersbourg, Floride, États-Unis

Clifford R. Merz

Département de cellule, microbiologie et biologie moléculaire, Université de Floride du Sud, Tampa, Floride, États-Unis

Neha Arora

Patel College of Global Sustainability, Université de Floride du Sud, Tampa, Floride, États-Unis

Michael Welch, Enlin Lo et George P. Philippidis

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CRM : Conceptualisation, Supervision, Administration du projet, Ressources, Acquisition de financement, Enquête, Tests de surveillance de la croissance des algues, Rédaction, révision et édition du brouillon original du manuscrit. NA : Méthodologie, culture d'algues, mesures de la fucoxanthine, révision et édition de manuscrits, MW : enquêtes en laboratoire, tests de surveillance de la croissance de la culture d'algues et récolte. EL : Composition biochimique et mesures FAME. GPP : Révision finale et édition du manuscrit.

Correspondance à Clifford R. Merz.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Merz, CR, Arora, N., Welch, M. et al. Caractéristiques de culture de microalgues utilisant un matériau d'emballage à coussin d'air disponible dans le commerce comme photobioréacteur. Sci Rep 13, 3792 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30080-6

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Reçu : 17 août 2022

Accepté : 15 février 2023

Publié: 07 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-30080-6

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